Ramon Babazadeh Alter

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Ramon Babazadeh Alter – Makrophagen sind der zahlreichste Zelltyp in infiziertem Gewebe und spielen durch ihre Fähigkeit, Infektionen zu beseitigen und ihre Stärke zu modulieren, eine wichtige Rolle sowohl bei der angeborenen als auch bei der adaptiven Immunantwort. Influenzavirus NS80 Die Pathogenität eines Virus wird erhöht, wenn es nur die ersten 80 Aminosäuren des NS1-Proteins kodiert. Fettgewebe wird von Peritonealmakrophagen befallen und infolge der Hypoxie werden Zytokine produziert.

Makrophagen wurden mit dem A/WSN/33 (WSN)- und NS80-Virus infiziert und normoxische und hypoxische Transkriptionsprofile des RIG-I-like-Rezeptor-Signalwegs und der Zytokinproduktion wurden verglichen, um die Funktion von Hypoxie bei der Regulierung der Immunantwort besser zu verstehen. Die Transkriptionsaktivität von IFN-, IFN-, IFN- und IFN-mRNA in infizierten Makrophagen wurde durch Hypoxie unterdrückt, ebenso wie das Wachstum von IC-21-Zellen und der Signalweg des RIG-I-ähnlichen Rezeptors.

Hypoxie reduzierte die Transkriptionsaktivität von IL-1- und Casp-1-mRNAs in infizierten Makrophagen, während Normoxie die Transkription beider mRNAs steigerte. Die Translationsfaktoren IRF4, IFN- und CXCL10, die alle eine Rolle bei der Kontrolle der Immunantwort und der Polarisation von Makrophagen spielen, wurden durch Hypoxie alle signifikant verändert.

Hypoxie hatte während der gesamten Kultivierung einen großen Einfluss auf die Expression entzündungsfördernder Zytokine sowohl in nicht infizierten als auch in infizierten Makrophagen. Dazu gehörten sICAM-1, IL-1, TNF-, CCL2, CCL3, CXCL12 und M-CSF. Unter Hypoxie induzierte das NS80-Virus eine stärkere Expression von M-CSF, IL-16, CCL2, CCL3 und CXCL12.

Basierend auf diesen Erkenntnissen scheint Hypoxie eine bedeutende Rolle bei der Aktivierung peritonealer Makrophagen sowie bei der Regulierung der angeborenen und adaptiven Immunantwort, der Veränderung der Produktion entzündungsfördernder Zytokine, der Förderung der Makrophagenpolarisierung und möglicherweise der Regulierung der Funktion anderer Immunzellen zu spielen.

Wenn der Sauerstoffgehalt des Gewebes unter einen bestimmten Schwellenwert sinkt, wird dieser Zustand als Hypoxie bezeichnet. Gewebehypoxie führt zu einem Anstieg des Blutlaktats und einer Umstellung auf einen anaeroben Zellstoffwechsel, was beides mit der Schwere der Erkrankung und der Mortalität bei Schwerkranken korreliert.

Die Biologie und Komorbiditäten von Fettleibigkeit werden durch Hypoxie erschwert. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) ermöglichen es Zellen, auf niedrige Sauerstoffwerte zu reagieren. Sauerstoffempfindliche Untereinheiten (HIF-1, HIF-2 und HIF-3) bilden Heterodimere mit der oxidunempfindlichen Untereinheit (HIF-1) und bilden so die HIF-Familie.

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Sowohl HIF-1 als auch HIF-1 sind Transkriptionsfaktoren, obwohl HIF-1 bedingt kontrolliert wird, während HIF-1 immer aktiv ist. Sowohl die Makrophageninvasion als auch die Zytokinerzeugung werden durch HIF-2 unterstützt. Die proinflammatorischen Zytokine IL-1 und TNF- erhöhen zusammen mit NF-B den HIF-1-Proteinspiegel und die Transkriptionsaktivität.

Darüber hinaus können Tumorzellen und Stroma auf Hypoxie reagieren, indem sie ihre Produktion der Chemokine CCL2, CCL5, CXCL12 und VEGF erhöhen. Hypoxie-induzierbare Faktoren (HIFs) können durch Viren aktiviert werden. Der HIF-1-Weg wird von Influenzaviren genutzt, um bei normalem Sauerstoffgehalt eine hypoxische Reaktion vorzutäuschen.

Die Familie Orthomyxoviridae, die Gattung Orthomyxovirus und die Spezies Influenzavirus sind die richtige Heimat für Influenzaviren. Influenzavirus-DNA Die RNA eines Virus ist einzelsträngig und kann für bis zu 18 verschiedene Proteine kodieren. Das NS1-Protein, dem Strukturelemente fehlen, ist ein Produkt des achten Segments. Das multifunktionale NS1-Protein hemmt die Immunantwort des Wirts und kontrolliert die Virusreplikation während der Infektion.

Das NS1-Protein besteht aus vier verschiedenen Regionen: der N-terminalen Domäne, der Linkerregion, der Effektorregion und der C-terminalen Region. Die N-terminalen und Effektordomänen sind durch eine kurze Linkerregion getrennt. Die N-terminale RNA-Bindungsdomäne des NS1-Proteins ist entscheidend für die virale mRNA-Translation und für die Unterdrückung der /-Interferon-Reaktion.

Durch die Hemmung der Aktivität von IRF3, NF-kappa B und cJun/ATF2 blockiert die Effektordomäne die Produktion von Typ-I-Interferonen. Die Modulation der Pathogenität und möglicherweise die Interaktion mit PDZ-bindenden Proteinen sind zwei zusätzliche Funktionen der C-terminalen Region.

Makrophagen helfen als Phagozyten bei der Clearance des Influenzavirus, der Entfernung von Zelltrümmern und der Präsentation von Antigenen gegenüber T-Zellen als Teil der adaptiven Immunantwort. Makrophagen kommen in jedem Organ als vielfältige Population von Immunzellen vor.

Homöostase, naive Immunantwort, Gewebeumbau und Wundheilung sind nur einige der vielen Rollen, die sie erfüllen. Die Hauptaufgabe von Makrophagen besteht darin, das Immunsystem bei der Abwehr schädlicher Eindringlinge zu unterstützen. Makrophagen entstehen aus Monozyten im Knochenmark und im Blut und befinden sich im Gewebe.

Ramon Babazadeh Alter : 38 Jahre alt (geboren 15. Juni 1985)

Die Physiologie von Makrophagen wird durch die lokalen Reize, denen sie ausgesetzt sind, und die Umgebung, in der sie sich befinden, beeinflusst. Alveolarmakrophagen leben im Lumen der Atemwege und steuern die homöostatische Funktion der Atemwege und die ersten Reaktionen des Körpers auf Lungenerkrankungen.

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Es wurde angenommen, dass eine Infektion von Makrophagen durch das Influenzavirus tödlich sein würde. Neuere Untersuchungen haben jedoch gezeigt, dass sich hochpathogene H5N1-Viren und einige H1N1-Influenzastämme effektiv in Makrophagen vermehren können.

Veränderungen in der Makrophagenaktivität und der Fähigkeit, Virusinfektionen zu beseitigen, sind das Ergebnis einer produktiven Influenza-Infektion. M1-Makrophagen setzen eine Flut entzündungsfördernder Zytokine frei, nachdem sie durch Influenzaviren aktiviert wurden. Zu diesen Zytokinen gehören IL-1, TNF-, IL-6, IL-12 und IL-23.

Interferon-regulatorischer Faktor 3 (IRF3), IRF4 (IRF4), Signalwandler und Aktivator der Transkription 1 (STAT1), STAT3 (STAT3), Hypoxie-induzierbarer Faktor 1 (HIF1) und Aktivatorprotein 1 (AP1) sind alle an der Regulierung der Expression dieser Zytokine beteiligt [25]. IL-10, IL-1, TNF-, CCL1, CCL2, CCL17, CCL18, CCL22, der transformierende Wachstumsfaktor Beta (TGF-) und der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) sind einige der Zytokine, die von M2-Makrophagen freigesetzt werden .

In dieser Studie haben wir untersucht, wie sich Hypoxie auf die Produktion entzündungsfördernder Zytokine und die Stimulation des RIG-I-ähnlichen Rezeptor-Signalwegs in mit dem Influenza-A-Virus infizierten Peritonealmakrophagen auswirkt. Wir haben zuvor gezeigt, dass das NS1-Protein die Zytokinprofile in der Lunge infizierter Mäuse beeinflusst und in den Zellen zu niedrigeren Titern anwächst.

Basierend auf unseren Erkenntnissen ist das NS1-verkürzte Virus (NS80) in der Lage, eine produktive Infektion in Makrophagen zu etablieren und die Transkriptionsmuster von Genen zu verändern, die am Signalweg des RIG-I-ähnlichen Rezeptors und der Zytokinproduktion beteiligt sind. Als Reaktion auf Hypoxie war die Expression bestimmter Zytokine erhöht und die Expression von Genen, die am Signalweg des RIG-I-ähnlichen Rezeptors beteiligt sind, herunterreguliert.

Das NS1-Protein hatte auch erhebliche Auswirkungen auf die Zytokinproduktion. Roswell Park Memorial Institute Medium 1640 (Lonza) mit 10 % Rinderserum (HyClone Laboratories) wurde zur Kultivierung der Maus-Peritonealmakrophagen IC-21 (TIB-186) und Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (ATCC CCL81) zur Kultivierung von Vero-Zellen (ATCC CCL81) aus der American Type Culture Collection verwendet. Einige Beispiele für H1N1-Viren sind A/New Caledonia/20/1999, A/PR/8/34 und A/California/7/2004.

Sowohl die Stämme A/Mississippi/1/85 (H3N2) als auch A/chicken Germany/27 (H7N7) wurden erfolgreich in befruchteten Hühnereiern kultiviert, die 10 Tage alt waren. Der Ansatz der umgekehrten Genetik wurde verwendet, um A/WSN/33 (H1N1) und NS80 zu erzeugen, ein Virus, das bis auf eine Verkürzung der Effektor- und C-terminalen Domänen des NS1-Proteins mit WSN identisch ist [28]. Beide Viren wurden in Vero-Zellen gehalten, denen die Fähigkeit zur Expression funktioneller IFNs fehlt, da die NS80-Virusreplikation in solchen Zellen erheblich gehemmt ist.

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In 35-mm-Petrischalen wurden die IC-21-Zellen ausgesät. Nach sechs Stunden wurden die Zellen in zwei Gruppen aufgeteilt und entweder unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen auf separaten Petrischalen gezüchtet. Unter Verwendung der InvivO2 Hypoxia 300 Workstation (Ruskinn Technology Ltd, Bridgend, UK) wurden die Zellen in einem Sauerstoff/Kohlenmonoxid-Gasgemisch aus 1 % O2 und 5 % CO2 inkubiert.

Eine Infektion mit dem Influenza-A/WSN/33- (H1N1) oder NS80-Virus bei einer MOI von 4 trat nach 48-stündiger Kultur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf. Die Temperatur der Absorption betrug 37 Grad Celsius. Bei den Zellen handelte es sich um serumfreies RPMI, das nach dreimaligem Waschen mit PBS nach der Adsorption unter normoxischen oder hypoxischen Bedingungen bei 37 °C gezüchtet wurde. Die Zellen wurden 24 und 48 Stunden nach der Infektion abgekratzt und 2 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert.

Die Überstände und Sedimente wurden bei 80 Grad Celsius eingefroren. Die Viruskonzentrationen wurden durch Zentrifugieren der Überstände infizierter Zellen bestimmt. Die Virustiter wurden unter Verwendung der seriellen Vero-Zelltitration als TCID50-Titer berechnet. Die Titer wurden nach dem Ansatz von Reed und Muench bestimmt. Der TCID50/ml-Titer wurde mit 0,7 multipliziert, um die durchschnittliche PFU/ml-Zahl zu erhalten.

Fluoreszenzmarkierung erfolgt indirekt

Die IC-21-Zellen wurden entweder in normaler Luft oder bei niedrigem Sauerstoffgehalt auf Glasdeckgläsern kultiviert. Eine Infektion mit dem Influenza-A/WSN/33- (H1N1) oder NS80-Virus bei einer MOI von 4 trat nach 48-stündiger Kultur in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf.

Nach 24 Stunden wurden die Zellen mit 3 % Paraformaldehyd eingefroren, mit 0,01 % Triton in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) permeabilisiert und in unverdünntem Hybridommedium mit dem monoklonalen Anti-Human-CA IX-Maus-Antikörper M75 immunmarkiert, wie zuvor von beschrieben.

An Alexa Fluor 488 konjugierte Anti-Maus-Sekundärantikörper wurden in PBS mit 1 % Rinderserumalbumin (BSA) verdünnt, um den Primärantikörper sichtbar zu machen. 10 Minuten lang wurde DAPI verwendet, um die Kerne anzufärben. Zur Untersuchung der Zellen wurde ein konfokales Zeiss 510 Meta LSM-Mikroskop verwendet.

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